确保足够的细胞生长是收集准确的细胞培养数据的关键部分。细胞可以悬浮培养，也可以作为单层细胞附着在培养器皿（如烧瓶、培养皿或多孔板）上贴壁培养。培养方法取决于细胞的内源表型和来源组织——因此，来自血液的细胞通常悬浮生长，而来自实体组织的细胞通常单层贴壁生长。协同培养一个既包含贴壁细胞又包含悬浮表型的混合种群也是可能的。
对于单层生长的细胞，汇合度被定义为通过显微镜观察时被一层细胞覆盖的培养器皿表面积的百分比。例如，汇合度50%意味着培养皿、烧瓶等表面的一半被细胞覆盖。对于悬浮细胞，生长过程通常通过细胞系或类型的推荐细胞密度来衡量，但“汇合度”可以通过浑浊度增加和培养基颜色稳定来评估。
培养细胞的生长通常分为四个阶段，当以细胞数的对数对时间作图时，会生成一个S型曲线，尽管不同细胞和培养物在每个阶段需要的时间是不同的。
潜伏期细胞正在适应培养条件，并且在此阶段不分裂。细胞附着通常发生在培养开始后的4小时内。该阶段的总长度取决于开始培养时细胞的生长阶段和接种密度。
对数生长期在此阶段，细胞正处于分裂活跃期，这是评估细胞增长以及收集通用数据的最佳时间。在细胞过度拥堵导致细胞生长压力之前的对数生长期后期是细胞传代的最佳时间。
静止期随着细胞达到%汇合度，该阶段细胞的生长减慢，只有不到十分之一的细胞处在活跃期中。细胞在这个阶段最容易受到损伤，因此需要仔细观察以确保细胞在该阶段之前或之初进行传代。
衰亡期作为细胞周期自然组成部分，随着细胞死亡在此阶段占主导地位，活细胞数量下降。
评估细胞生长
准确的细胞计数在评估培养物中的细胞生长时至关重要，因为错误的计数可能会导致有关细胞健康情况的错误结论。可以使用血细胞计数器确定细胞数。然而，利用库尔特原理的自动细胞计数仪可以使细胞一个一个地流过电传感器内的一个孔，从而产生最精确的细胞计数。
细胞生长不良常见原因及解决方案储存物解冻后无活细胞或活细胞少
原因
解决方案
储存培养物质量不佳
确保正确识别了用于储存的起始培养物，该培养物是健康的，无微生物污染的，并且处于生长的对数阶段后期（80-90%汇合度）
储存物冷冻不当
在液氮中冷冻细胞时，请确保细胞、培养基和其他实际的浓度以及冷冻方案遵循供应商的建议。通常，应以每分钟约1至3℃的速度缓慢冻结，以最大程度地减少冰晶的形成。
为细胞选择最合适的冷冻保护剂。如果使用甘油，请勿将其储存在光线下，因为光照会使甘油转化为具有细胞*性的丙烯醛。
储存物保存不当
存储物应始终保持在低于-℃的温度下，理想状况是在液氮中。
储存物解冻不当
解冻细胞时，请遵循供应商推荐的方案。通常细胞应该迅速解冻，需使用预热的介质。
尽快除去含有冷冻保护剂的培养基，以防止细胞活性下降。
确保小心处理细胞，不要进行涡旋和高速离心，因为细胞在冻存后特别容易受到损伤。
解冻或传代后细胞附着不佳
原因
解决方案
在塑料培养容器上的静电积聚（尤其是在低湿度的情况下）
增加室内温度。用（消*过的）湿毛巾擦拭培养器皿外部。使用放静电装置
细胞、培养基和/或其他试剂混合不充分
确保细胞和所有试剂的溶液充分混合
滚瓶的转动太快
以缓慢的速度旋转瓶子
细胞生长缓慢
原因
解决方案
细胞传代次数过多
取用一个新的传代培养基次数较少的存储细胞
收获时细胞过度汇合
使用新的存储细胞开始培养，并在达到%汇合度之前的对数期进行收获。
CO水平与所用培养基的碳酸氢盐缓冲系统需求的不匹配，导致对PH控制不足。
确保培养瓶中的CO水平符合缓冲系统中的需求。通常，缓冲液中碳酸氢盐浓度越高，培养箱中气体混合物所需的CO浓度越高。
将培养物暴露于荧光下导致光敏感的培养基组分（核*素、色氨酸和HEPES）转化为有细胞*性的自由基和HO。
将细胞和培养基放在暗处，避开荧光。
错误的细胞计数法
确保计数样品混合充分，以避免细胞密度局部差异影响细胞计数的准确性。再次检查使用细胞计数器手动方法的所有运算，或者考虑自动细胞计数方法。
细胞生长不均匀
原因
解决方案
容器内细胞、培养基混合不充分
通过轻轻涡旋确保细胞混合物和所有试剂适当混匀，移液管吹打以避免局部浓度差异。
同一时期相同的器皿之间的细胞生长不均匀可能是由于培养箱内的温度差异。
尽可能避免将培养器皿堆叠放置，因为底部的培养器皿最靠近金属架，可能升温最快。
预防和消除细胞生长问题的技巧和措施除了遵循良好的无菌操作规范以防止微生物和化学污染外，细胞生长问题的早期诊断和处理的关键还在于对培养物的频繁观察和详细的记录保存。同样重要的是，要考虑要采取的最有效的方法是详细而耗时地寻找导致细胞生长不良的罪魁祸首，还是干脆用全新的试剂、储存物和物料重新开始。
细心观察
为了解决细胞生长问题，首先必须意识到问题的存在。许多生长问题都是很细微的，所以定期详细地观察实验中所有培养器皿是必要的。在显微镜下快速评估可能是不够的，因为许多特殊的生长模式在细胞固定和染色之前并不明显。因此需要定期检查培养基和其他试剂以寻找污染。
准确记录
当试图诊断和排除细胞生长不良的问题时，对培养物的各个方面都有良好的记录可以节省时间、金钱和独特的经过改造的细胞，如基因敲除细胞系。例如，规范化细胞密度、记录储存细胞的传代次数对于了解储存细胞是否可能是问题的根源至关重要。同样地，在得出某一特定批次的培养基是罪魁祸首的结论之前，必须首先确定哪些培养皿使用了这个批次。
需要记录的重要信息包括所有冻存管的来源、身份和无污染证明、传代次数、细胞密度、冷冻和储存方案。还应记录使用的所有试剂的成分（和浓度）、批号和首次打开/使用日期。所有培养器皿的批号也应记录。细胞培养各方面的详细方案都应该标准化并遵循。所有冻存管和培养器皿的准确和详细的标签都至关重要。请注意小细节，比如是何时清洗和保养了培养箱，何时更换了CO罐，上一次何时对培养室进行支原体筛查，并记录任何反常的事情。
知道何时止损
有时，找到问题的确切根源不如解决问题那么重要，比起试图找出确切的问题，一次性纠正多种导致生长不良的潜在原因可能更节约时间和成本。例如，使用新的储存细胞和全新的培养基、血清、缓冲液等来重新开始，可能比分别单独尝试每种物料的新批次直到发现罪魁祸首更合情理。
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇