在上一期我们已经了解了细胞培养中常见的微生物污染以及在细胞层面的常见问题，今天我们来继续了解细胞培养中相关的问题~了解这些你就是细胞培养专家了哦~
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人为操作和环境
操作人员
从人身上掉落的颗粒达到10^?4/分钟（颗粒直径0.5um）
人类1小时会脱落3*10^?4～4*10^?4个细胞；24小时会脱落10^?8个细胞；一年会脱落3.6kg的死细胞
屋尘螨、粉尘螨-um
人类的皮肤总面积约2cm^?2,生活约10^12个微生物；我们1g的排遗物中有10^?12个微生物
细胞房
着装要求
操作细胞培养物前后应洗手。穿戴个人防护设备不仅可以保护您免受危险品污染，还可降低皮屑以及衣服上污染和灰尘污染培养的可能
正确穿衣顺序
换专用鞋
无尘手套（避免不洁的双手经穿着时粘附于无尘衣上）
网帽（带网帽时须确保头发不可暴露于网帽外，之后戴口罩遮住口罩）
无尘服（不要穿棉质衣服（脱落纤维）
鞋套
细胞培养实验室的设计原则及条件要求
设计原则：防止微生物污染和有害因素影响
条件要求
封闭、正压：隔离门和空调系统
温湿度：培养箱内是37度，饱和适度；室内是维度18度-26度，湿度是45%-65%
洁净度：空气洁净度等级是洁净空间单位体积空气中，以大于或等于被考虑粒径的离子最大浓度限值进行划分的等级标准。洁净度等级应在空态、静态和动态方法进行测试，使用尘埃粒子测试仪来测定
细胞培养实验室应在环境洁净度级和局部洁净度级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染
生物安全柜
实验物品和操作不要影响柜内气流
显微镜置物台
二氧化碳培养箱
水浴锅
震动
灭菌锅
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培养基
血清
如何保存血清？
无菌分装，冻存在-20度
存放于4度时，请勿超过一个月
如何解冻血清？
将血清从冷冻冰箱取出后，置于4度冰箱使之融解
溶解过程中，每隔一段时间均匀而缓慢的摇动血清
为什么血清会出现沉淀？
血清中沉淀物出现的原因有许多种，普遍的原因是由于血清中脂蛋白所造成（例如冷凝激素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等），其中血清纤维蛋白在血清解冻后，是造成沉淀物的主要原因之一。
血清中的沉淀物对细胞培养有什么影响？
血清中的沉淀不会影响细胞培养
血清解冻后有絮状沉淀物，该如何处理？
离心rpm，4度,5分钟
为免有絮状沉淀物，应避免
反复冻融
长期存放在4度
在室温时间过长
非必要，不用热灭活（导致蛋白变性）
基础培养基
自行配置时，需注意是否要另外添加营养物，必要时调整PH
使用不正确的培养基细胞可能仍可生长，但特性会发生改变
酚红是培养基中的PH指示剂，本身有微弱的雌激素效用，需注意是否影响实验。
添加因子
光照
所有培养试剂，建议避光保存！光线中的紫外线会破坏培养基中的HEPES（平衡盐），核*素与色氨酸，甚至是甘油，对细胞造成*害作用。
谷氨酰胺
谷氨酰胺是一种基本的氨基酸，为其它氨基酸、脂类、蛋白质、核酸的合成提供碳源和氮源。谷氨酰胺的浓度一般是2-5mM，是其它氨基酸的10-倍
谷氨酰胺缺乏会导致大部分细胞生长不良甚至死亡
谷氨酰胺容易降解，所以加有谷氨酰胺的培养液在4度冰箱中储存2周以上时，应重新加入谷氨酰胺，或可选用添加了长效型谷氨酰胺的培养基
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辅助试剂
胰酶
若发生消化时间逐渐拉长，或是细胞消化不下来，需注意是否一枚已经失活
反复冻融会影响胰酶活性，建议分装后-20度冻存
胰酶过度消化会伤害细胞，所以要使用缓冲液，血清或胰酶抑制剂清洗细胞
品质不佳的胰酶也容易带入支原体或动物性污染，若有此顾虑，可以选择重组胰酶
缓冲液
自行配置，要做到精确称量，PH调节，高温高压灭菌
冻存液
冻存液若含有DMSO，细胞冻存或复苏时，都不宜在冷冻管内悬浮太久，需尽快转移至下一操作步骤
冻存液若含有甘油，一定注意避光保存，否则会产生丙烯醛，*害细胞
抗生素
B-内酰胺类抗生素：青霉素
氨基糖苷类氨基糖类：链霉素、卡那霉素、庆大霉素
内酯类：两性霉素B、制霉菌素
注意使用剂量！
原代细胞培养时，因从组织分离时易带入污染
观察并且确认是微生物污染时
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